图1, 21中癌症中与RAS相关的13种基因突变及其突变类型和频率

RAS (rat sarcoma)是与肿瘤相关性较高的第二大原癌基因，且RAS的突变也会导致其它与癌症相关基因的突变，进而促进肿瘤的发生发展。

RAS是一类小G蛋白，由188个氨基酸组成，分布于细胞质膜内膜一侧，其活性处于动态变化之中，正常情况下，RAS与GDP结合时处于失活状态，然而当上游的receptor tyrosine kinases (RTK)磷酸化后，可以与growth-factor-receptor-boundprotein 2 (GRB2)的SHC domain结合，招募鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）(包括SOS蛋白)，这类蛋白催化KRAS与GTP的结合，从而促进RAS的激活，进而使得其下游的多种信号通路激活，比如MAPK,PI3K,RAL相关的通路等等（图2），最终促进细胞恶性增殖，并向癌变的方向发展。从结构上看，RAS蛋白的活性转变主要与两个switch区域有关，即switch I(30-38 aa)和switch II(59-76 aa)，RAS蛋白与GDP和GTP的结合时，这两个区域会形成不同的构象，可以看出RAS与GDP结合时，SWII处于开放状态。  

图2, RAS的活性构象变化及其介导的下游信号通路(switchI,蓝色；switchII,紫色)   RAS蛋白有四个亚型，KRAS（4a和4b）、HRAS、NRAS，其中KRAS突变的频率占RAS突变总数的85%，NRAS占比12%，而HRAS仅占3%(表1)。而KRAS中最常见的突变是G12D、G12C、G12V(图3), 结构研究表明，这些突变可以破坏GAP的活性，从而使得RAS一直与GTP结合，处于一直激活的状态。尽管KRAS致癌的机制研究的较为清楚，但KRAS由于结构中无明显的结合位点，被称为“不可成药靶点”。KRAS抑制剂开发的难点主要有： 1、KRAS与GDP和GTP有很强的亲和力（皮摩尔级别）且细胞内GDP和GTP的含量很高（微摩尔级别），因此很难设计合成竞争性抑制剂； 2、由于突变的KRAS和正常的KRAS具有很强的同源性，因此很难设计选择性抑制突变型KRAS的抑制剂等。  

表1 RAS蛋白亚型突变率与其相关癌症                 

 图3, KRAS中常见的基因突变类型以及其在各种癌症中所占的比重 于是MarieEvangelista团队设想能否通过抗体来固定KRAS的构象，使其处于SWII打开的状态，便于筛选KRAS的抑制剂。首先作者构建了几种处于不同构象的RASG12C，KRASG12C-GDP+GNE-1952(一种共价抑制剂)、KRASG12C-GDP、KRASG12C-GMPPCP(一种不可以水解的GTP类似物)，利用这三种蛋白通过ELISA实验进行3-4轮的筛选，得到了对共价抑制剂稳定的SWII开放构象的KRASG12C有较强选择性的抗体，后续通过SPR实验，在其它多种共价抑制剂存在的情况下进行了验证，得到了可以稳定KRASG12C的构象的单抗1A5和2H11。

图4，文章设计思路图  

图5 conformation-locking antibodies for molecular probes(CLAMPs)筛选   接着作者利用免疫荧光实验发现1A5CLAMPs 可以用来监测细胞内KRASG12C动态共价修饰的过程，a图显示1A15可以识别不同共价抑制剂导致的SWII构象，且在KRASG12C低表达的细胞中同样有效(6d)，此外，1A15可以浓度依赖和时间依赖的监测细胞内KRASG12C共价修饰的进程(6b)。  

图6，免疫荧光实验显示1A5可以监测细胞内KRASG12C动态共价修饰 此外，作者选取了现有的KRAS抗体，DMSO和共价抑制剂ARS-1620处理细胞后，利用IP实验发现抗体iDab可以选择性识别SWII关闭构象的KRAS(7a)，这正好与1A5相反，于是作者又利用ELISA对其进行了复测，发现结果与IP一致(7b)。后续免疫荧光实验表明，在低浓度的共价抑制剂处理细胞时，iDab可以标记未被结合的KRASG12C，随着浓度的升高，KRASG12C逐渐被共价抑制剂结合，进而可以被1A5标记。

图7，1A5CLAMP的延申   后续，作者开展了利用2H11进行了KRASG12C抑制剂筛选的工作，首先SPR实验(8a)显示2H11能够显著提高现有共价抑制剂和KRASWT的亲和力，接着作者在含有3060个片段的片段库中对其进行了筛选，筛选的成功率从1.5%上升到了3.3%，而且成功筛选了许多与SWII开放构象的KRASG12C有较高亲和力的片段(8b),同时作者选取其中的两个片段，利用SPR实验检测其与不同构象的KRASG12C的结合，发现这两个片段确实能选择性的作用于SWII开放构象的KRASG12C，这证明了这一方法在筛选KRAS抑制剂中的可行性。同时作者解析了KRASG12C在与2H11Fab和筛选到的片段GNE-2897的共晶结构，结构显示此时GNE-2897结合在SWII的口袋中，且GNE-2897与已知的KRASG12C的共价抑制剂的作用口袋一致。

图8 利用CLAMPs进行KRAS抑制剂的筛选 除了KRAS外，还有一些功能或活性与结构密切相关的蛋白的别构激动剂或抑制剂的筛选也可以用抗体固定构象的方法，已经应用于GPCR家族受体：β-肾上腺素能受体[5-6]、Kappa鸦片受体[7]等，总之这一技术对于动态不可成药蛋白的药物研究有重要意义。

图9 筛选能够固定kappa 受体活性构象的抗体示意图